一、操作前準(zhǔn)備：保障實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)

1. 環(huán)境與設(shè)備校驗(yàn)

環(huán)境要求 ：

溫度：15-30℃（恒定±1℃）

濕度：≤80%

遠(yuǎn)離震動(dòng)源（如離心機(jī)、搖床）

開機(jī)校驗(yàn) ：

啟動(dòng)后執(zhí)行自動(dòng)光學(xué)校準(zhǔn) （≥30分鐘預(yù)熱）

使用標(biāo)準(zhǔn)校準(zhǔn)板驗(yàn)證孔間信號(hào)一致性（CV值＜5%）

2. 耗材與試劑選擇

專用耗材 ：

僅使用原廠認(rèn)證96孔板 （如MicroAmp™ Optical Plate）

匹配光學(xué)級(jí)封膜 （防止蒸發(fā)與透光干擾）

試劑規(guī)范 ：

預(yù)混試劑提前解凍（冰上操作），避免反復(fù)凍融

反應(yīng)體系推薦：20-50μL （低體積需校準(zhǔn)加樣精度）

二、標(biāo)準(zhǔn)化操作流程

Step 1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與軟件設(shè)置

創(chuàng)建新程序：

命名實(shí)驗(yàn)（例：靶標(biāo)分子_202405）

選擇檢測通道（FAM/VIC/ROX等，支持5通道同步）

設(shè)置反應(yīng)程序：

Step 2 加樣與上機(jī)

分區(qū)操作防污染 ：

試劑配制區(qū)（潔凈臺(tái)） → 樣本處理區(qū)（生物安全柜） → 擴(kuò)增分析區(qū)（獨(dú)立空間）

反應(yīng)體系構(gòu)建：

模板DNA：≤100 ng/孔

引物/探針：按預(yù)混試劑說明書濃度添加

推薦體系：

預(yù)混試劑 10 μL + 引物探針 2 μL + 模板 3 μL + ddH?O 5 μL  

上機(jī)操作：

孔板輕震離心（避免氣泡）

按A1→H12順序 放置，確?？孜慌c軟件匹配

Step 3 運(yùn)行監(jiān)控與數(shù)據(jù)分析

實(shí)時(shí)監(jiān)控：

軟件界面查看擴(kuò)增曲線 與熒光閾值（ΔRn）

異常孔位標(biāo)記（如信號(hào)跳躍、無擴(kuò)增）

結(jié)果解讀：

Ct值判定 ：閾值線設(shè)定在指數(shù)擴(kuò)增期（建議自動(dòng)計(jì)算）

熔解曲線 ：單峰=特異性擴(kuò)增，多峰=引物二聚體

三、關(guān)鍵注意事項(xiàng)與排障方案

四、日常維護(hù)與校準(zhǔn)

每周維護(hù) ：

用無絨布蘸70%乙醇清潔樣品槽

檢查散熱濾網(wǎng)（積塵降低制冷效率）

五、安全與合規(guī)聲明

本操作需在BSL-1級(jí)實(shí)驗(yàn)室 環(huán)境下進(jìn)行：

穿戴實(shí)驗(yàn)服、手套及護(hù)目鏡

廢棄耗材按《實(shí)驗(yàn)室生物安全手冊(cè)》分類處置

設(shè)備僅用于科研與質(zhì)檢用途